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Con lo sviluppo di nuovi materiali ultra morbidi per dispositivi medici e applicazioni biomediche, la caratterizzazione completa delle loro proprietà fisiche e meccaniche è importante e impegnativa.È stata applicata una tecnica di nanoindentazione con microscopia a forza atomica modificata (AFM) per caratterizzare il modulo superficiale estremamente basso della nuova lente a contatto in silicone idrogel biomimetico lehfilcon A rivestita con uno strato di strutture a pennello polimeriche ramificate.Questo metodo consente la determinazione precisa dei punti di contatto senza gli effetti dell'estrusione viscosa quando ci si avvicina ai polimeri ramificati.Inoltre, consente di determinare le caratteristiche meccaniche dei singoli elementi della spazzola senza l'effetto della poroelasticità.Ciò si ottiene selezionando una sonda AFM con un design (dimensioni della punta, geometria e rigidità della molla) particolarmente adatto per misurare le proprietà di materiali morbidi e campioni biologici.Questo metodo migliora la sensibilità e la precisione per la misurazione accurata del materiale molto morbido lehfilcon A, che ha un modulo di elasticità estremamente basso sulla superficie (fino a 2 kPa) e un'elasticità estremamente elevata nell'ambiente acquoso interno (quasi il 100%) .I risultati dello studio della superficie non solo hanno rivelato le proprietà superficiali ultra morbide della lente lehfilcon A, ma hanno anche mostrato che il modulo delle spazzole polimeriche ramificate era paragonabile a quello del substrato di silicio-idrogeno.Questa tecnica di caratterizzazione della superficie può essere applicata ad altri materiali ultra morbidi e dispositivi medici.
Le proprietà meccaniche dei materiali progettati per il contatto diretto con i tessuti viventi sono spesso determinate dall'ambiente biologico.La perfetta corrispondenza di queste proprietà del materiale aiuta a raggiungere le caratteristiche cliniche desiderate del materiale senza causare risposte cellulari avverse1,2,3.Per materiali bulk omogenei, la caratterizzazione delle proprietà meccaniche è relativamente facile grazie alla disponibilità di procedure e metodi di prova standard (ad es. microindentazione4,5,6).Tuttavia, per materiali ultra morbidi come gel, idrogel, biopolimeri, cellule viventi, ecc., questi metodi di test non sono generalmente applicabili a causa dei limiti di risoluzione delle misurazioni e della disomogeneità di alcuni materiali7.Nel corso degli anni, i metodi tradizionali di indentazione sono stati modificati e adattati per caratterizzare un'ampia gamma di materiali morbidi, ma molti metodi soffrono ancora di gravi carenze che ne limitano l'uso8,9,10,11,12,13.La mancanza di metodi di prova specializzati in grado di caratterizzare in modo accurato e affidabile le proprietà meccaniche dei materiali supersoft e degli strati superficiali ne limita fortemente l'uso in varie applicazioni.
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo introdotto la lente a contatto lehfilcon A (CL), un materiale eterogeneo morbido con tutte le proprietà superficiali ultra morbide derivate da design potenzialmente biomimetici ispirati alla superficie della cornea dell'occhio.Questo biomateriale è stato sviluppato innestando uno strato polimerico ramificato e reticolato di poli(2-metacriloilossietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) su un idrogel di silicone (SiHy) 15 progettato per dispositivi medici a base di.Questo processo di innesto crea uno strato sulla superficie costituito da una struttura a spazzola polimerica ramificata molto morbida ed altamente elastica.Il nostro lavoro precedente ha confermato che la struttura biomimetica di lehfilcon A CL fornisce proprietà superficiali superiori come una migliore prevenzione della bagnatura e delle incrostazioni, una maggiore lubrificazione e una ridotta adesione cellulare e batterica15,16.Inoltre, l'uso e lo sviluppo di questo materiale biomimetico suggerisce anche un'ulteriore espansione ad altri dispositivi biomedici.Pertanto, è fondamentale caratterizzare le proprietà superficiali di questo materiale ultra morbido e comprendere la sua interazione meccanica con l'occhio al fine di creare una base di conoscenze completa per supportare sviluppi e applicazioni futuri.La maggior parte delle lenti a contatto SiHy disponibili in commercio sono composte da una miscela omogenea di polimeri idrofili e idrofobi che formano una struttura materiale uniforme17.Sono stati condotti diversi studi per indagare le loro proprietà meccaniche utilizzando i tradizionali metodi di prova di compressione, trazione e microindentazione18,19,20,21.Tuttavia, il nuovo design biomimetico di lehfilcon A CL lo rende un materiale eterogeneo unico in cui le proprietà meccaniche delle strutture a spazzola polimerica ramificata differiscono significativamente da quelle del substrato di base SiHy.Pertanto, è molto difficile quantificare con precisione queste proprietà utilizzando metodi convenzionali e di indentazione.Un metodo promettente utilizza il metodo di test della nanoindentazione implementato nella microscopia a forza atomica (AFM), un metodo che è stato utilizzato per determinare le proprietà meccaniche di materiali viscoelastici morbidi come cellule e tessuti biologici, nonché polimeri morbidi22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.Nella nanoindentazione AFM, i fondamenti del test di nanoindentazione sono combinati con gli ultimi progressi nella tecnologia AFM per fornire una maggiore sensibilità di misurazione e test di un'ampia gamma di materiali intrinsecamente supersoft31,32,33,34,35,36.Inoltre, la tecnologia offre altri importanti vantaggi attraverso l'utilizzo di diverse geometrie.penetratore e sonda e la possibilità di test in vari fluidi liquidi.
La nanoindentazione AFM può essere condizionatamente suddivisa in tre componenti principali: (1) apparecchiature (sensori, rilevatori, sonde, ecc.);(2) parametri di misurazione (quali forza, spostamento, velocità, dimensione della rampa, ecc.);(3) Elaborazione dei dati (correzione della linea di base, stima del punto di contatto, adattamento dei dati, modellazione, ecc.).Un problema significativo con questo metodo è che diversi studi in letteratura che utilizzano la nanoindentazione AFM riportano risultati quantitativi molto diversi per lo stesso tipo di campione/cella/materiale37,38,39,40,41.Ad esempio, Lecca et al.L'influenza della geometria della sonda AFM sul modulo di Young misurato di campioni di idrogel meccanicamente omogeneo e cellule eterogenee è stata studiata e confrontata.Riferiscono che i valori del modulo dipendono fortemente dalla selezione del cantilever e dalla forma della punta, con il valore più alto per una sonda a forma di piramide e il valore più basso di 42 per una sonda sferica.Allo stesso modo, Selhuber-Unkel et al.È stato dimostrato come la velocità del penetratore, le dimensioni del penetratore e lo spessore dei campioni di poliacrilammide (PAAM) influenzano il modulo di Young misurato dalla nanoindentazione ACM43.Un altro fattore di complicazione è la mancanza di materiali di prova standard a modulo estremamente basso e di procedure di prova libere.Ciò rende molto difficile ottenere risultati accurati con sicurezza.Tuttavia, il metodo è molto utile per misurazioni relative e valutazioni comparative tra tipi di campioni simili, ad esempio utilizzando la nanoindentazione AFM per distinguere le cellule normali dalle cellule tumorali 44, 45.
Quando si testano materiali morbidi con nanoindentazione AFM, una regola generale consiste nell'usare una sonda con una bassa costante elastica (k) che corrisponda strettamente al modulo del campione e una punta emisferica/rotonda in modo che la prima sonda non perfori le superfici del campione su primo contatto con materiali morbidi.È anche importante che il segnale di deflessione generato dalla sonda sia sufficientemente forte da essere rilevato dal sistema di rilevamento laser24,34,46,47.Nel caso di cellule, tessuti e gel eterogenei ultra morbidi, un'altra sfida consiste nel superare la forza adesiva tra la sonda e la superficie del campione per garantire misurazioni riproducibili e affidabili48,49,50.Fino a poco tempo, la maggior parte del lavoro sulla nanoindentazione AFM si è concentrata sullo studio del comportamento meccanico di cellule biologiche, tessuti, gel, idrogel e biomolecole utilizzando sonde sferiche relativamente grandi, comunemente denominate sonde colloidali (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Queste punte hanno un raggio da 1 a 50 µm e sono comunemente realizzate in vetro borosilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), polistirene (PS), biossido di silicio (SiO2) e diamante- come il carbonio (DLC).Sebbene la nanoindentazione CP-AFM sia spesso la prima scelta per la caratterizzazione di campioni morbidi, ha i suoi problemi e limiti.L'uso di punte sferiche grandi, di dimensioni micron, aumenta l'area di contatto totale della punta con il campione e si traduce in una significativa perdita di risoluzione spaziale.Per campioni morbidi e disomogenei, dove le proprietà meccaniche degli elementi locali possono differire significativamente dalla media su un'area più ampia, l'indentazione CP può nascondere qualsiasi disomogeneità nelle proprietà su scala locale52.Le sonde colloidali sono tipicamente realizzate attaccando sfere colloidali di dimensioni micron a cantilever senza punta utilizzando adesivi epossidici.Lo stesso processo di produzione è irto di molti problemi e può portare a incoerenze nel processo di calibrazione della sonda.Inoltre, la dimensione e la massa delle particelle colloidali influenzano direttamente i principali parametri di calibrazione del cantilever, come la frequenza di risonanza, la rigidità della molla e la sensibilità alla deflessione56,57,58.Pertanto, i metodi comunemente usati per le sonde AFM convenzionali, come la calibrazione della temperatura, potrebbero non fornire una calibrazione accurata per CP e potrebbero essere necessari altri metodi per eseguire queste correzioni57, 59, 60, 61. I tipici esperimenti di indentazione CP utilizzano grandi deviazioni a sbalzo per studiare le proprietà dei campioni morbidi, il che crea un altro problema quando si calibra il comportamento non lineare del cantilever a deviazioni relativamente grandi62,63,64.I moderni metodi di indentazione della sonda colloidale di solito tengono conto della geometria del cantilever utilizzato per calibrare la sonda, ma ignorano l'influenza delle particelle colloidali, che crea ulteriore incertezza nell'accuratezza del metodo38,61.Allo stesso modo, i moduli elastici calcolati dall'adattamento del modello di contatto dipendono direttamente dalla geometria della sonda di indentazione e la mancata corrispondenza tra le caratteristiche della punta e della superficie del campione può portare a imprecisioni27, 65, 66, 67, 68. Alcuni lavori recenti di Spencer et al.Vengono evidenziati i fattori che dovrebbero essere presi in considerazione quando si caratterizzano le spazzole polimeriche morbide utilizzando il metodo di nanoindentazione CP-AFM.Hanno riferito che la ritenzione di un fluido viscoso nelle spazzole polimeriche in funzione della velocità comporta un aumento del carico sulla testa e quindi diverse misurazioni delle proprietà dipendenti dalla velocità30,69,70,71.
In questo studio, abbiamo caratterizzato il modulo superficiale del materiale ultra-morbido altamente elastico lehfilcon A CL utilizzando un metodo di nanoindentazione AFM modificato.Date le proprietà e la nuova struttura di questo materiale, la gamma di sensibilità del metodo di indentazione tradizionale è chiaramente insufficiente per caratterizzare il modulo di questo materiale estremamente morbido, quindi è necessario utilizzare un metodo di nanoindentazione AFM con sensibilità maggiore e minore sensibilità.livello.Dopo aver esaminato le carenze e i problemi delle attuali tecniche di nanoindentazione della sonda AFM colloidale, mostriamo perché abbiamo scelto una sonda AFM più piccola e progettata su misura per eliminare la sensibilità, il rumore di fondo, il punto di contatto preciso, misurare il modulo di velocità di materiali eterogenei morbidi come la ritenzione di liquidi dipendenza.e precisa quantificazione.Inoltre, siamo stati in grado di misurare con precisione la forma e le dimensioni della punta della rientranza, consentendoci di utilizzare il modello cono-sfera fit per determinare il modulo di elasticità senza valutare l'area di contatto della punta con il materiale.Le due assunzioni implicite quantificate in questo lavoro sono le proprietà completamente elastiche del materiale e il modulo indipendente dalla profondità di indentazione.Utilizzando questo metodo, abbiamo prima testato standard ultra-morbidi con un modulo noto per quantificare il metodo, quindi abbiamo utilizzato questo metodo per caratterizzare le superfici di due diversi materiali per lenti a contatto.Questo metodo di caratterizzazione delle superfici di nanoindentazione AFM con maggiore sensibilità dovrebbe essere applicabile a un'ampia gamma di materiali ultrasoft eterogenei biomimetici con potenziale utilizzo in dispositivi medici e applicazioni biomediche.
Le lenti a contatto Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) e i loro substrati di idrogel di silicone sono stati scelti per esperimenti di nanoindentazione.Nell'esperimento è stato utilizzato un innesto per obiettivo appositamente progettato.Per installare l'obiettivo per il test, è stato posizionato con cura sul supporto a forma di cupola, assicurandosi che non entrassero bolle d'aria, quindi fissato con i bordi.Un foro nel dispositivo nella parte superiore del supporto dell'obiettivo fornisce l'accesso al centro ottico dell'obiettivo per esperimenti di nanoindentazione mentre si tiene il liquido in posizione.Ciò mantiene le lenti completamente idratate.Come soluzione di prova sono stati utilizzati 500 μl di soluzione per il confezionamento di lenti a contatto.Per verificare i risultati quantitativi, sono stati preparati idrogel di poliacrilammide non attivata (PAAM) disponibili in commercio da una composizione di poliacrilammide-co-metilen-bisacrilammide (piastre Petrisoft Petri da 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, USA), un modulo elastico noto di 1 kPa.Utilizzare 4-5 gocce (circa 125 µl) di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS di Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) e 1 goccia di soluzione per lenti a contatto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA).) all'interfaccia idrogel-sonda AFM.
Campioni di substrati Lehfilcon A CL e SiHy sono stati visualizzati utilizzando un sistema di microscopio elettronico a scansione a emissione di campo FEI Quanta 250 (FEG SEM) dotato di un rilevatore di microscopio elettronico a trasmissione a scansione (STEM).Per preparare i campioni, le lenti sono state prima lavate con acqua e tagliate a spicchi a forma di torta.Per ottenere un contrasto differenziale tra i componenti idrofili e idrofobi dei campioni, è stata utilizzata come colorante una soluzione stabilizzata allo 0,10% di RuO4, in cui i campioni sono stati immersi per 30 min.La colorazione lehfilcon A CL RuO4 è importante non solo per ottenere un migliore contrasto differenziale, ma aiuta anche a preservare la struttura delle spazzole polimeriche ramificate nella loro forma originale, che sono quindi visibili sulle immagini STEM.Sono stati quindi lavati e disidratati in una serie di miscele di etanolo/acqua con concentrazione crescente di etanolo.I campioni sono stati quindi colati con resina epossidica EMBed 812/Araldite, che ha indurito durante la notte a 70°C.I blocchi campione ottenuti dalla polimerizzazione della resina sono stati tagliati con un ultramicrotomo e le sezioni sottili risultanti sono state visualizzate con un rivelatore STEM in modalità a basso vuoto a una tensione di accelerazione di 30 kV.Lo stesso sistema SEM è stato utilizzato per la caratterizzazione dettagliata della sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).Le immagini SEM della sonda AFM sono state ottenute in una tipica modalità ad alto vuoto con una tensione di accelerazione di 30 kV.Acquisire immagini a diverse angolazioni e ingrandimenti per registrare tutti i dettagli della forma e delle dimensioni della punta della sonda AFM.Tutte le dimensioni della punta di interesse nelle immagini sono state misurate digitalmente.
Un microscopio a forza atomica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) con modalità "PeakForce QNM in Fluid" è stato utilizzato per visualizzare e nanoindentare lehfilcon A CL, substrato SiHy e campioni di idrogel PAAm.Per gli esperimenti di imaging, è stata utilizzata una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) con un raggio nominale della punta di 1 nm per acquisire immagini ad alta risoluzione del campione a una velocità di scansione di 0,50 Hz.Tutte le immagini sono state scattate in soluzione acquosa.
Gli esperimenti di nanoindentazione AFM sono stati condotti utilizzando una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).La sonda AFM ha una punta di silicio su un cantilever di nitruro di 345 nm di spessore, 54 µm di lunghezza e 4,5 µm di larghezza con una frequenza di risonanza di 45 kHz.È specificamente progettato per caratterizzare ed eseguire misurazioni nanomeccaniche quantitative su campioni biologici morbidi.I sensori sono calibrati individualmente in fabbrica con impostazioni della molla precalibrate.Le costanti elastiche delle sonde utilizzate in questo studio erano comprese tra 0,05 e 0,1 N/m.Per determinare con precisione la forma e le dimensioni della punta, la sonda è stata caratterizzata in dettaglio mediante SEM.Sulla fig.La Figura 1a mostra una micrografia elettronica a scansione ad alta risoluzione e basso ingrandimento della sonda PFQNM-LC-A-CAL, che fornisce una visione olistica del design della sonda.Sulla fig.1b mostra una vista ingrandita della parte superiore della punta della sonda, fornendo informazioni sulla forma e le dimensioni della punta.All'estremità, l'ago è un emisfero di circa 140 nm di diametro (Fig. 1c).Al di sotto di questo, la punta si assottiglia in una forma conica, raggiungendo una lunghezza misurata di circa 500 nm.Al di fuori della regione rastremata, la punta è cilindrica e termina con una lunghezza totale della punta di 1,18 µm.Questa è la parte funzionale principale della punta della sonda.Inoltre, per i test è stata utilizzata anche una grande sonda sferica in polistirene (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) con un diametro della punta di 45 µm e una costante elastica di 2 N/m come sonda colloidale.con sonda PFQNM-LC-A-CAL 140 nm per confronto.
È stato riportato che il liquido può essere intrappolato tra la sonda AFM e la struttura della spazzola polimerica durante la nanoindentazione, che eserciterà una forza verso l'alto sulla sonda AFM prima che tocchi effettivamente la superficie69.Questo effetto di estrusione viscosa dovuto alla ritenzione di fluido può modificare il punto di contatto apparente, influenzando così le misurazioni del modulo superficiale.Per studiare l'effetto della geometria della sonda e della velocità di indentazione sulla ritenzione di liquidi, sono state tracciate curve di forza di indentazione per campioni di lehfilcon A CL utilizzando una sonda di diametro di 140 nm a velocità di spostamento costanti di 1 µm/s e 2 µm/s.diametro della sonda 45 µm, impostazione della forza fissa 6 nN raggiunta a 1 µm/s.Gli esperimenti con una sonda di 140 nm di diametro sono stati condotti a una velocità di indentazione di 1 µm/s e una forza impostata di 300 pN, scelta per creare una pressione di contatto all'interno dell'intervallo fisiologico (1–8 kPa) della palpebra superiore.pressione 72. Campioni morbidi già pronti di idrogel PAA con una pressione di 1 kPa sono stati testati per una forza di indentazione di 50 pN a una velocità di 1 μm/s utilizzando una sonda con un diametro di 140 nm.
Poiché la lunghezza della parte conica della punta della sonda PFQNM-LC-A-CAL è di circa 500 nm, per qualsiasi profondità di indentazione < 500 nm si può presumere con sicurezza che la geometria della sonda durante l'indentazione rimarrà fedele alla sua forma conica.Inoltre, si assume che la superficie del materiale in esame presenti una risposta elastica reversibile, che sarà confermata anche nelle sezioni successive.Pertanto, a seconda della forma e delle dimensioni della punta, abbiamo scelto il modello di raccordo cono-sfera sviluppato da Briscoe, Sebastian e Adams, disponibile nel software del fornitore, per elaborare i nostri esperimenti di nanoindentazione AFM (NanoScope).Software di analisi dei dati di separazione, Bruker) 73. Il modello descrive la relazione forza-spostamento F(δ) per un cono con un difetto all'apice sferico.Sulla fig.La figura 2 mostra la geometria di contatto durante l'interazione di un cono rigido con una punta sferica, dove R è il raggio della punta sferica, a è il raggio di contatto, b è il raggio di contatto all'estremità della punta sferica, δ è il raggio di contattoprofondità di indentazione, θ è il semiangolo del cono.L'immagine al SEM di questa sonda mostra chiaramente che la punta sferica di 140 nm di diametro si fonde tangenzialmente in un cono, quindi qui b è definito solo attraverso R, cioè b = R cos θ.Il software fornito dal fornitore fornisce una relazione cono-sfera per calcolare i valori del modulo di Young (E) dai dati di separazione della forza assumendo a > b.Relazione:
dove F è la forza di indentazione, E è il modulo di Young, ν è il rapporto di Poisson.Il raggio di contatto a può essere stimato utilizzando:
Schema della geometria dei contatti di un cono rigido con punta sferica pressata nel materiale di una lente a contatto Lefilcon con uno strato superficiale di pennelli polimerici ramificati.
Se a ≤ b, la relazione si riduce all'equazione per un penetratore sferico convenzionale;
Riteniamo che l'interazione della sonda di indentazione con la struttura ramificata della spazzola polimerica PMPC farà sì che il raggio di contatto a sia maggiore del raggio di contatto sferico b.Pertanto, per tutte le misurazioni quantitative del modulo elastico eseguite in questo studio, abbiamo utilizzato la dipendenza ottenuta per il caso a > b.
I materiali biomimetici ultrasoft studiati in questo studio sono stati ripresi in modo completo utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione (STEM) della sezione trasversale del campione e la microscopia a forza atomica (AFM) della superficie.Questa caratterizzazione superficiale dettagliata è stata eseguita come estensione del nostro lavoro precedentemente pubblicato, in cui abbiamo determinato che la struttura a spazzola polimerica dinamicamente ramificata della superficie lehfilcon A CL modificata da PMPC mostrava proprietà meccaniche simili al tessuto corneale nativo 14 .Per questo motivo, ci riferiamo alle superfici delle lenti a contatto come materiali biomimetici14.Sulla fig.3a, b mostrano sezioni trasversali di strutture di spazzole polimeriche PMPC ramificate sulla superficie di un substrato lehfilcon A CL e di un substrato SiHy non trattato, rispettivamente.Le superfici di entrambi i campioni sono state ulteriormente analizzate utilizzando immagini AFM ad alta risoluzione, che hanno ulteriormente confermato i risultati dell'analisi STEM (Fig. 3c, d).Nel loro insieme, queste immagini danno una lunghezza approssimativa della struttura del pennello polimerico ramificato PMPC a 300-400 nm, che è fondamentale per interpretare le misurazioni della nanoindentazione AFM.Un'altra osservazione chiave derivata dalle immagini è che la struttura superficiale complessiva del materiale biomimetico CL è morfologicamente diversa da quella del materiale del substrato SiHy.Questa differenza nella loro morfologia superficiale può diventare evidente durante la loro interazione meccanica con la sonda AFM rientrante e successivamente nei valori del modulo misurati.
Immagini STEM trasversali di (a) lehfilcon A CL e (b) substrato SiHy.Barra della scala, 500 nm.Immagini AFM della superficie del substrato lehfilcon A CL (c) e del substrato SiHy di base (d) (3 µm × 3 µm).
I polimeri bioispirati e le strutture a pennello polimerico sono intrinsecamente morbidi e sono stati ampiamente studiati e utilizzati in varie applicazioni biomediche74,75,76,77.Pertanto, è importante utilizzare il metodo di nanoindentazione AFM, che può misurare in modo accurato e affidabile le loro proprietà meccaniche.Ma allo stesso tempo, le proprietà uniche di questi materiali ultra morbidi, come il modulo elastico estremamente basso, l'elevato contenuto di liquido e l'elevata elasticità, spesso rendono difficile scegliere il materiale, la forma e la forma giusti della sonda di indentazione.misurare.Questo è importante affinché il penetratore non perfori la superficie morbida del campione, il che comporterebbe errori nel determinare il punto di contatto con la superficie e l'area di contatto.
Per questo, è essenziale una comprensione completa della morfologia dei materiali biomimetici ultra morbidi (lehfilcon A CL).Le informazioni sulle dimensioni e sulla struttura delle spazzole polimeriche ramificate ottenute utilizzando il metodo di imaging forniscono la base per la caratterizzazione meccanica della superficie utilizzando tecniche di nanoindentazione AFM.Invece di sonde colloidali sferiche di dimensioni micron, abbiamo scelto la sonda al nitruro di silicio PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) con un diametro della punta di 140 nm, appositamente progettata per la mappatura quantitativa delle proprietà meccaniche dei campioni biologici 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Il razionale per l'utilizzo di sonde relativamente taglienti rispetto alle sonde colloidali convenzionali può essere spiegato dalle caratteristiche strutturali del materiale.Confrontando la dimensione della punta della sonda (~ 140 nm) con le spazzole polimeriche ramificate sulla superficie di CL lehfilcon A, mostrate in Fig. 3a, si può concludere che la punta è abbastanza grande da entrare in contatto diretto con queste strutture a spazzola, che riduce la possibilità che la punta li perfori.Per illustrare questo punto, in Fig. 4 c'è un'immagine STEM del lehfilcon A CL e della punta rientrante della sonda AFM (disegnata in scala).
Schema che mostra l'immagine STEM di lehfilcon A CL e una sonda di indentazione ACM (disegnata in scala).
Inoltre, la dimensione della punta di 140 nm è abbastanza piccola da evitare il rischio di uno qualsiasi degli effetti di estrusione appiccicosa precedentemente riportati per le spazzole polimeriche prodotte con il metodo di nanoindentazione CP-AFM69,71.Partiamo dal presupposto che, a causa della speciale forma cono-sferica e delle dimensioni relativamente ridotte di questa punta AFM (Fig. 1), la natura della curva di forza generata dalla nanoindentazione lehfilcon A CL non dipenderà dalla velocità di indentazione o dalla velocità di carico/scarico .Pertanto, non è influenzato dagli effetti poroelastici.Per verificare questa ipotesi, i campioni di lehfilcon A CL sono stati indentati a una forza massima fissa utilizzando una sonda PFQNM-LC-A-CAL, ma a due velocità diverse, e le curve di forza di trazione e retrazione risultanti sono state utilizzate per tracciare la forza (nN) in separazione (µm) è mostrato in Figura 5a.È chiaro che le curve di forza durante il carico e lo scarico si sovrappongono completamente e non vi è alcuna chiara evidenza che il taglio della forza a profondità di indentazione zero aumenti con la velocità di indentazione nella figura, suggerendo che i singoli elementi della spazzola sono stati caratterizzati senza un effetto poroelastico.Al contrario, gli effetti di ritenzione del fluido (estrusione viscosa e effetti di poroelasticità) sono evidenti per la sonda AFM di 45 m di diametro alla stessa velocità di indentazione e sono evidenziati dall'isteresi tra le curve di allungamento e retrazione, come mostrato nella Figura 5b.Questi risultati supportano l'ipotesi e suggeriscono che le sonde di 140 nm di diametro sono una buona scelta per caratterizzare tali superfici morbide.
lehfilcon A CL curve di forza di indentazione utilizzando ACM;(a) utilizzando una sonda con un diametro di 140 nm a due velocità di caricamento, dimostrando l'assenza di un effetto poroelastico durante l'indentazione superficiale;(b) utilizzando sonde con un diametro di 45 µm e 140 nm.s mostrano gli effetti dell'estrusione viscosa e della poroelasticità per sonde grandi rispetto a sonde più piccole.
Per caratterizzare le superfici ultrasoft, i metodi di nanoindentazione AFM devono avere la sonda migliore per studiare le proprietà del materiale in esame.Oltre alla forma e alle dimensioni della punta, la sensibilità del sistema di rilevamento AFM, la sensibilità alla deflessione della punta nell'ambiente di test e la rigidità del cantilever svolgono un ruolo importante nel determinare l'accuratezza e l'affidabilità della nanoindentazione.misurazioni.Per il nostro sistema AFM, il limite di rilevamento del rilevatore sensibile alla posizione (PSD) è di circa 0,5 mV e si basa sulla velocità della molla precalibrata e sulla sensibilità alla deflessione del fluido calcolata della sonda PFQNM-LC-A-CAL, che corrisponde al sensibilità teorica al carico.è inferiore a 0,1 pN.Pertanto, questo metodo consente la misurazione di una forza di indentazione minima ≤ 0,1 pN senza alcuna componente di rumore periferico.Tuttavia, è quasi impossibile per un sistema AFM ridurre il rumore periferico a questo livello a causa di fattori quali vibrazioni meccaniche e dinamica dei fluidi.Questi fattori limitano la sensibilità complessiva del metodo di nanoindentazione AFM e determinano anche un segnale di rumore di fondo di circa ≤ 10 pN.Per la caratterizzazione della superficie, i campioni di substrato lehfilcon A CL e SiHy sono stati rientrati in condizioni completamente idratate utilizzando una sonda da 140 nm per la caratterizzazione SEM e le curve di forza risultanti sono state sovrapposte tra forza (pN) e pressione.Il grafico di separazione (µm) è mostrato nella Figura 6a.Rispetto al substrato di base SiHy, la curva di forza lehfilcon A CL mostra chiaramente una fase di transizione che inizia nel punto di contatto con la spazzola polimerica a forcella e termina con un brusco cambiamento nel contatto della punta con il materiale sottostante.Questa parte transitoria della curva di forza evidenzia il comportamento veramente elastico della spazzola polimerica ramificata sulla superficie, come evidenziato dalla curva di compressione che segue da vicino la curva di tensione e dal contrasto nelle proprietà meccaniche tra la struttura della spazzola e il materiale SiHy voluminoso.Quando si confrontano lefilcon.Separazione della lunghezza media di una spazzola polimerica ramificata nell'immagine STEM del PCS (Fig. 3a) e della sua curva di forza lungo l'ascissa in Fig. 3a.6a mostra che il metodo è in grado di rilevare la punta e il polimero ramificato che raggiungono la sommità della superficie.Contatto tra strutture a spazzola.Inoltre, una stretta sovrapposizione delle curve di forza indica che non vi è alcun effetto di ritenzione di liquidi.In questo caso, non c'è assolutamente adesione tra l'ago e la superficie del campione.Le sezioni superiori delle curve di forza per i due campioni si sovrappongono, riflettendo la somiglianza delle proprietà meccaniche dei materiali del substrato.
(a) curve di forza di nanoindentazione AFM per substrati lehfilcon A CL e substrati SiHy, (b) curve di forza che mostrano la stima del punto di contatto utilizzando il metodo della soglia del rumore di fondo.
Per studiare i dettagli più fini della curva di forza, la curva di tensione del campione lehfilcon A CL viene tracciata nuovamente in Fig. 6b con una forza massima di 50 pN lungo l'asse y.Questo grafico fornisce informazioni importanti sul rumore di fondo originale.Il rumore è nell'intervallo di ±10 pN, che viene utilizzato per determinare con precisione il punto di contatto e calcolare la profondità di indentazione.Come riportato in letteratura, l'identificazione dei punti di contatto è fondamentale per valutare accuratamente le proprietà dei materiali come il modulo85.Un approccio che prevede l'elaborazione automatica dei dati della curva di forza ha mostrato un migliore adattamento tra l'adattamento dei dati e le misurazioni quantitative per i materiali morbidi86.In questo lavoro, la nostra scelta dei punti di contatto è relativamente semplice e obiettiva, ma ha i suoi limiti.Il nostro approccio conservativo per determinare il punto di contatto può comportare valori di modulo leggermente sovrastimati per profondità di indentazione inferiori (<100 nm).L'uso del rilevamento del punto di contatto basato su algoritmi e dell'elaborazione automatizzata dei dati potrebbe essere una continuazione di questo lavoro in futuro per migliorare ulteriormente il nostro metodo.Pertanto, per il rumore di fondo intrinseco dell'ordine di ± 10 pN, definiamo il punto di contatto come il primo punto dati sull'asse x nella Figura 6b con un valore di ≥ 10 pN.Quindi, in accordo con la soglia di rumore di 10 pN, una linea verticale a livello di ~0,27 µm segna il punto di contatto con la superficie, dopodiché la curva di stiramento continua fino a quando il substrato incontra la profondità di indentazione di ~270 nm.È interessante notare che, in base alle dimensioni delle caratteristiche del pennello polimerico ramificato (300-400 nm) misurate utilizzando il metodo di imaging, la profondità di indentazione del campione CL lehfilcon A osservato utilizzando il metodo della soglia del rumore di fondo è di circa 270 nm, che è molto vicino a la dimensione di misura con STEM.Questi risultati confermano ulteriormente la compatibilità e l'applicabilità della forma e delle dimensioni della punta della sonda AFM per l'indentazione di questa struttura a spazzola polimerica ramificata molto morbida e altamente elastica.Questi dati forniscono anche una forte evidenza a sostegno del nostro metodo di utilizzo del rumore di fondo come soglia per individuare i punti di contatto.Pertanto, qualsiasi risultato quantitativo ottenuto dalla modellazione matematica e dall'adattamento della curva di forza dovrebbe essere relativamente accurato.
Le misurazioni quantitative mediante metodi di nanoindentazione AFM dipendono completamente dai modelli matematici utilizzati per la selezione dei dati e la successiva analisi.Pertanto, è importante considerare tutti i fattori relativi alla scelta del penetratore, alle proprietà del materiale e alla meccanica della loro interazione prima di scegliere un particolare modello.In questo caso, la geometria della punta è stata accuratamente caratterizzata utilizzando micrografie SEM (Fig. 1) e, sulla base dei risultati, la sonda nanoindenting AFM da 140 nm di diametro con un cono duro e una geometria della punta sferica è una buona scelta per caratterizzare i campioni di lehfilcon A CL79 .Un altro fattore importante che deve essere attentamente valutato è l'elasticità del materiale polimerico in esame.Sebbene i primi dati di nanoindentazione (Figg. 5a e 6a) delineino chiaramente le caratteristiche della sovrapposizione delle curve di tensione e compressione, ovvero il completo recupero elastico del materiale, è estremamente importante confermare la natura prettamente elastica dei contatti .A tal fine, sono state eseguite due rientranze successive nella stessa posizione sulla superficie del campione lehfilcon A CL a una velocità di indentazione di 1 µm/s in condizioni di piena idratazione.I dati della curva di forza risultante sono mostrati in fig.7 e, come previsto, le curve di espansione e compressione delle due stampe sono pressoché identiche, evidenziando l'elevata elasticità della struttura a pennello in polimero ramificato.
Due curve di forza di indentazione nella stessa posizione sulla superficie di lehfilcon A CL indicano l'elasticità ideale della superficie della lente.
Sulla base delle informazioni ottenute dalle immagini SEM e STEM rispettivamente della punta della sonda e della superficie lehfilcon A CL, il modello cono-sfera è una ragionevole rappresentazione matematica dell'interazione tra la punta della sonda AFM e il materiale polimerico morbido in fase di test.Inoltre, per questo modello cono-sfera, le ipotesi fondamentali sulle proprietà elastiche del materiale impresso valgono per questo nuovo materiale biomimetico e vengono utilizzate per quantificare il modulo elastico.
Dopo una valutazione completa del metodo di nanoindentazione AFM e dei suoi componenti, comprese le proprietà della sonda di indentazione (forma, dimensione e rigidità della molla), la sensibilità (stima del rumore di fondo e del punto di contatto) e i modelli di adattamento dei dati (misurazioni quantitative del modulo), il metodo è stato usato.caratterizzare campioni ultra-morbidi disponibili in commercio per verificare i risultati quantitativi.Un idrogel commerciale di poliacrilammide (PAAM) con un modulo elastico di 1 kPa è stato testato in condizioni idratate utilizzando una sonda da 140 nm.I dettagli sui test e sui calcoli dei moduli sono forniti nelle Informazioni supplementari.I risultati hanno mostrato che il modulo medio misurato era di 0,92 kPa e la %RSD e la deviazione percentuale (%) dal modulo noto erano inferiori al 10%.Questi risultati confermano l'accuratezza e la riproducibilità del metodo di nanoindentazione AFM utilizzato in questo lavoro per misurare i moduli dei materiali ultrasoft.Le superfici dei campioni di lehfilcon A CL e del substrato di base SiHy sono state ulteriormente caratterizzate utilizzando lo stesso metodo di nanoindentazione AFM per studiare il modulo di contatto apparente della superficie ultrasoft in funzione della profondità di indentazione.Le curve di separazione della forza di indentazione sono state generate per tre campioni di ciascun tipo (n = 3; una rientranza per campione) a una forza di 300 pN, una velocità di 1 µm/s e idratazione completa.La curva di condivisione della forza di indentazione è stata approssimata utilizzando un modello cono-sfera.Per ottenere il modulo dipendente dalla profondità di indentazione, è stata impostata una porzione larga 40 nm della curva di forza ad ogni incremento di 20 nm a partire dal punto di contatto, e i valori misurati del modulo ad ogni passo della curva di forza.SpinCy et al.Un approccio simile è stato utilizzato per caratterizzare il gradiente di modulo delle spazzole polimeriche di poli (lauril metacrilato) (P12MA) utilizzando la nanoindentazione della sonda AFM colloidale e sono coerenti con i dati che utilizzano il modello di contatto Hertz.Questo approccio fornisce un grafico del modulo di contatto apparente (kPa) rispetto alla profondità di indentazione (nm), come mostrato nella Figura 8, che illustra il modulo di contatto apparente/gradiente di profondità.Il modulo elastico calcolato del campione CL lehfilcon A è compreso tra 2 e 3 kPa entro i 100 nm superiori del campione, oltre il quale inizia ad aumentare con la profondità.D'altra parte, quando si testa il substrato di base SiHy senza una pellicola simile a un pennello sulla superficie, la profondità di indentazione massima raggiunta a una forza di 300 pN è inferiore a 50 nm e il valore del modulo ottenuto dai dati è di circa 400 kPa , che è paragonabile ai valori del modulo di Young per i materiali sfusi.
Modulo di contatto apparente (kPa) rispetto alla profondità di indentazione (nm) per i substrati lehfilcon A CL e SiHy utilizzando il metodo di nanoindentazione AFM con geometria cono-sfera per misurare il modulo.
La superficie superiore della nuova struttura a spazzola polimerica ramificata biomimetica presenta un modulo di elasticità estremamente basso (2-3 kPa).Questo corrisponderà all'estremità sospesa libera della spazzola polimerica biforcuta come mostrato nell'immagine STEM.Sebbene ci siano alcune prove di un gradiente di modulo sul bordo esterno del CL, il substrato principale ad alto modulo è più influente.Tuttavia, i primi 100 nm della superficie rientrano nel 20% della lunghezza totale della spazzola polimerica ramificata, quindi è ragionevole presumere che i valori misurati del modulo in questo intervallo di profondità di indentazione siano relativamente accurati e non fortemente dipendono dall'effetto dell'oggetto inferiore.
A causa dell'esclusivo design biomimetico delle lenti a contatto lehfilcon A, costituite da strutture a spazzola polimerica PMPC ramificate innestate sulla superficie dei substrati SiHy, è molto difficile caratterizzare in modo affidabile le proprietà meccaniche delle loro strutture superficiali utilizzando metodi di misurazione tradizionali.Qui presentiamo un metodo di nanoindentazione AFM avanzato per caratterizzare con precisione materiali ultra morbidi come lefilcon A con alto contenuto di acqua ed elasticità estremamente elevata.Questo metodo si basa sull'uso di una sonda AFM la cui dimensione e geometria della punta sono accuratamente scelte per corrispondere alle dimensioni strutturali delle caratteristiche della superficie ultra morbida da imprimere.Questa combinazione di dimensioni tra sonda e struttura fornisce una maggiore sensibilità, permettendoci di misurare il basso modulo e le proprietà elastiche intrinseche degli elementi a spazzola polimerici ramificati, indipendentemente dagli effetti poroelastici.I risultati hanno mostrato che le esclusive spazzole polimeriche PMPC ramificate caratteristiche della superficie della lente avevano un modulo elastico estremamente basso (fino a 2 kPa) e un'elasticità molto elevata (quasi il 100%) quando testate in un ambiente acquoso.I risultati della nanoindentazione AFM ci hanno anche permesso di caratterizzare l'apparente modulo di contatto/gradiente di profondità (30 kPa/200 nm) della superficie della lente biomimetica.Questo gradiente può essere dovuto alla differenza di modulo tra le spazzole polimeriche ramificate e il substrato SiHy, o la struttura ramificata/densità delle spazzole polimeriche, o una loro combinazione.Tuttavia, sono necessari ulteriori studi approfonditi per comprendere appieno la relazione tra struttura e proprietà, in particolare l'effetto della ramificazione delle spazzole sulle proprietà meccaniche.Misurazioni simili possono aiutare a caratterizzare le proprietà meccaniche della superficie di altri materiali ultra morbidi e dispositivi medici.
I set di dati generati e/o analizzati durante lo studio in corso sono disponibili presso i rispettivi autori su ragionevole richiesta.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. e Haugen, HJ Reazioni biologiche alle proprietà fisiche e chimiche delle superfici dei biomateriali.Chimico.società.ed.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM e Liu, X. Miglioramento dei biomateriali di origine umana per l'ingegneria tissutale.programmazione.polimero.la scienza.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Progettazione, implementazione clinica e risposta immunitaria di biomateriali nella medicina rigenerativa.Nazionale Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK e Farr GM Un metodo migliorato per determinare la durezza e il modulo elastico utilizzando esperimenti di indentazione con misurazioni di carico e spostamento.J. Alma mater.serbatoio di stoccaggio.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Origini storiche dei test di durezza per indentazione.alma mater.la scienza.tecnologie.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Misure di durezza dell'indentazione su macro, micro e nanoscala: una revisione critica.tribù.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD e Clapperich, SM Gli errori di rilevamento della superficie portano a una sovrastima del modulo nella nanoindentazione di materiali morbidi.J.Mecca.Comportamento.Scienze Biomediche.alma mater.2, 312-317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR e Yahya M.Yu.Valutazione del metodo di nanoindentazione per determinare le caratteristiche meccaniche di nanocompositi eterogenei utilizzando metodi sperimentali e computazionali.la scienza.Casa 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR e Owart, TS Caratterizzazione meccanica di gel viscoelastici morbidi mediante indentazione e analisi degli elementi finiti inversa basata sull'ottimizzazione.J.Mecca.Comportamento.Scienze Biomediche.alma mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J e Chaneler D. Ottimizzazione della determinazione della viscoelasticità utilizzando sistemi di misurazione compatibili.Materia soffice 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. e Pellillo, E. Nanoindentazione di superfici polimeriche.J. Fisica.D. Fai domanda per la fisica.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. e Van Vliet KJ Caratterizzazione delle proprietà meccaniche viscoelastiche di polimeri altamente elastici e tessuti biologici mediante indentazione d'urto.Giornale di biomateriali.71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Valutazione del modulo elastico e del lavoro di adesione di materiali morbidi utilizzando il metodo esteso Borodich-Galanov (BG) e indentazione profonda.pelliccia.alma mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al.Morfologia su scala nanometrica e proprietà meccaniche delle superfici polimeriche biomimetiche delle lenti a contatto in silicone idrogel.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).